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凋亡小体_

时间:2018-10-11 18:38 来源:http://www.ynkqw.com 作者:恒耀娱乐 点击:
凋亡小体 凋亡体是细胞凋亡过程中形成的一种大型的季节性蛋白质结构。其响应内部(内在)或外部(外部)细胞死亡刺激从线粒体释放细胞色素C引发其形成。刺激可以从DNA损伤和病毒感染到发育提示,例如导致蝌蚪尾巴退化的提示。 在哺乳动物细胞中,一旦细胞色素c被释放,它就与胞质蛋白Apaf-1结合以促进凋亡体的形成。早期的生化研究提示细胞色素C与apaf-1之比为2:1,以形成凋亡小体。然而,最近的结构研究表明细胞色素c与apaf-1的比例是一对一的。也已经表明核苷酸dATP作为第三组分与apaf-1结合,然而它的确切作用仍然存在争议。哺乳动物凋亡小体从未结晶,但10年前通过低温透射电子显微镜以较低的(2nm)分辨率成像了人类APAF-1 /细胞色素-c凋亡体,[2] [2]揭示了轮状颗粒具有7重对称性。最近,人类凋亡小体的中等分辨率(9.5埃)结构也通过冷冻电子显微镜解析,其允许明确推断所有APAF-1结构域(CARD,NBARC和WD40)和细胞色素c的位置。现在还有单体的无活性Apaf-1亚基(PDB 3SFZ)的晶体结构。[1] [3]一旦形成,凋亡体可以招募并激活无活性的pro-caspase-9。一旦激活,该启动子半胱天冬酶可以激活效应子半胱氨酸蛋白酶并触发导致细胞凋亡的一系列事件。 Apoptosome这个术语在Yoshihide Tsujimoto的1998年的论文“Bcl-2家族蛋白在凋亡中的作用:凋亡体或线粒体?”中首次引入[4],然而,在此之前Apoptosome是已知的三元复合体, caspase-9和Bcl-XL,它们分别结合一个特定的Apaf-1结构域,然后认为这种复合物的形成在哺乳动物细胞死亡中起调节作用[5]。同年12月又发表了一篇文章在生物化学杂志上指出Apaf-1是通过激活procaspase-9来调节细胞凋亡。[6] 凋亡体的标准在1999年制定。首先,它必须是一个大型复合体(大于130万道尔顿)。其次,其形成需要水解ATP或dATP的高能键。最后,它必须以其功能形式激活procaspase-9。这种复合物的形成是不可逆转的,并且会发生细胞凋亡。稳定的APAF-1和细胞色素多肽复合物符合这种描述,现在称为凋亡体[7]。 由于两个原因,凋亡小体被认为是多聚体复合体。首先,将多个procaspase-9分子靠近在一起进行切割。其次,为了提高细胞凋亡的阈值,因此细胞色素c的非特异性渗漏不会导致细胞凋亡[7]。 一旦凋亡体被确定为procaspase-9激活剂,该途径中的突变就成为一个重要的研究领域。一些例子包括人类白血病细胞,卵巢癌和病毒感染。[8] [9] [10]该路径的当前研究领域将进一步详细讨论。还存在隐藏的细胞死亡途径,其独立于APAF-1并因此是凋亡体。这些途径也独立于胱天蛋白酶-3和9.这些凋亡的隐藏途径较慢,但可能在进一步的研究中证明有用[11]。 凋亡小体是在衔接蛋白Apaf1(凋亡蛋白酶活化因子1)周围组装的多分子全酶复合物,其在线粒体介导的细胞凋亡后必须被某种类型的应激信号刺激T形成凋亡体需要ATP / dATP和细胞色素c的存在在胞浆中[12]应激刺激可以触发细胞色素c释放到细胞质中,然后在含有多个WD-40重复的区域内与Apaf-1的C端结合[2]。 Apaf-1的寡聚化似乎伴随着procaspase-9同步募集到Apaf-1 N末端的CARD基序[2]。凋亡体触发细胞凋亡内在途径中半胱天冬酶的激活[12]。 具有七重对称结构的凋亡小体的轮状七聚体复合物首先在电子低温显微镜技术下以27Å分辨率显示,并具有约1MDa的计算质量(Acehan等,2002)。[2]这种轮状颗粒有七个辐条和一个中心毂。轮辐的远端区域具有明显的Y形。[12]集线器域通过弯曲臂连接到Y域。每个Y结构域包含两个细胞色素C结合位点之间的叶片(大的和小的)[12]。由于凋亡小体结构的分辨率相对较低,提出了两种有争议的凋亡体装配模型。一个模型表明NOD域构成中心枢纽,而CARD域在NOD区域顶部形成更自由的环。[2]另一个模型提出,Apaf-1以延伸的方式组织,使得N-末端CARD和核苷酸结合区形成凋亡体的中心枢纽,而13个WD-40重复构成两个叶[12]。大叶由7个重复组成,小叶由6个重复组成[12]。每个caspase-9分子结合中央枢纽处的CARD结构域,形成圆顶状结构[12]。这一争议已经通过最近人类凋亡体 - 胱天蛋白酶-9 CARD复合物的高分辨率结构得到解决[1]。这种结构清楚地表明,只有NOD区域形成凋亡体的中心枢纽(见图片),而CARD与凋亡体的平台灵活连接,并在基态凋亡体中变得紊乱[1]。一旦凋亡体与procaspase-9结合,Apaf-1 CARDs和procaspase-9 CARDs就会形成柔性盘状结构,位于平台上方[1]。 WD-40重复次数也被证明是15次而不是13次[1],它由7叶片β螺旋桨和8叶片β螺旋桨组成[1]。 来自Wang和他的同事的证据表明,procaspase-9与Apaf-1在化合物中的化学计量比约为1:1 [7]。这一点通过定量质谱分析得到进一步证明[13]。证明复合物中细胞色素c与Apaf-1的化学计量比为1:1。[1]关于是否需要在寡聚化后稳定掺入细胞色素c进入凋亡体,还有一些争论,但最近的结构数据支持细胞色素c稳定寡聚体人类凋亡体的观点[1]。然而,细胞色素c可能不需要在非哺乳动物物种如蠕虫和果蝇中装配凋亡小体[14]。此外,其他几种分子,最值得注意的是caspase-3已被报道与凋亡体共同纯化[7],caspase-3已被证明能够结合凋亡体 - procaspase-9复合物[13]。 Apaf-1形成凋亡体的主链。它具有三个不同的区域:N端半胱天冬酶募集结构域(CARD,残基1-90),中央核苷酸结合和寡聚化区(NB-ARC / NOD,128-586)和C端WD40区613-1248)构成约140KDa的蛋白质。[2] 含有保守沃克盒A(p环155-161)和B(239-243)的短接头和核苷酸结合a / b结构域(NBD)跟随N-末端CARD结构域[2]。 Walker盒A / B对于dATP / ATP和Mg2 结合是至关重要的[1] [2] NBD之后是一个小螺旋结构域(HD1),第二个连接子和一个保守翼状螺旋结构域(WHD)。[2] NOD区域包含NBD,HD1和WHD,形成属于AAA 家族ATP酶一部分的ATPase结构域。[1] [2]在NOD和WD-40重复之间的连接处存在超螺旋结构域(HD2)[1]。 WD40重复序列分成八组和七组,连接子连接它们[1]。 以上描述针对人类凋亡体。如图所示,来自其它生物体的凋亡小体复合体结构具有许多相似性,但是具有不同的大小和数量的亚基。果蝇系统,称为黑暗,有8个亚基环(PDB 4V4L)。[14]线虫凋亡体,称为CED-4,是八聚体但是小得多(PDB 3LQQ),并且不包括会结合细胞色素C的区域。[15] 凋亡体作用的启动对应于程序性细胞死亡(PCD)途径的第一步。在动物中,细胞凋亡可以通过两种方式之一来催化;外在途径涉及细胞外配体与跨膜受体的结合,而内在途径发生在线粒体中[16]。这种内在途径涉及细胞色素C从线粒体释放并随后与胞质蛋白Apaf-1结合[16] [17]。因此细胞色素c释放对于启动凋亡体作用是必需的;这种释放受到多种方式的调节,最重要的是通过检测钙离子水平。[16] 细胞色素c释放建议以两种方式之一进行。首先,线粒体接收到死亡诱导信号时的通透性转换孔(PTP),并释放膜间隙蛋白(12)。 PTP由电压依赖性阴离子通道(VDAC),内膜蛋白腺嘌呤核苷酸转位子(AdNT)和基质蛋白亲环蛋白D(CyD)组成(12)。这种毛孔引起线粒体肿胀和线粒体外膜破裂(Diamond&McCabe,2007)。随着渗透性的这种变化,蛋白质如细胞色素c被释放到胞质溶胶中(12)。这种变化可能会导致线粒体跨膜转换(MPT),线粒体跨膜电位崩溃,ATP产生停止(12)。药物环孢菌素A(CsA)抑制该方法导致发现第二种途径(13)。第二种细胞色素c释放方法与PTP无关,只涉及VDAC。 Bcl-2家族促凋亡蛋白的成员可以诱导VDAC的开放(12)。这将导致相同的膜间间隙蛋白释放,包括细胞色素c和随后发生的MPT(12)。 在不存在细胞色素c的情况下,Apaf-1以其单体形式存在;据认为WD-40结构域仍保持折叠回蛋白质上,使Apaf-1处于自动抑制状态[16]。另外,几个区域的伤口很紧密,以至于蛋白质无法与任何其他物质结合[16]。通过质谱测定已经确定,在自动抑制或“锁定”状态下,ADP与Apaf-1的ATP酶结构域结合[16]。在这种状态下,这种蛋白质是单一的,不能激活任何半胱天冬酶。 细胞色素c结合Apaf-1的WD-40结构域[16]。这允许“锁定”被释放,这意味着该域不再是自动禁止的。[1] [16]但是,CARD和NB-ARC域仍处于自动抑制状态。[16]当Apaf-1与(d)ATP / ATP结合时,CARD域将仅从该锁中释放;当ATP结合时,CARD结构域将被允许与胱天蛋白酶-9结合[1] [16]。当ADP处于ATP酶结构域时,寡聚化受到抑制。因此,ATP的结合还允许Apaf-1寡聚化为下游胱天蛋白酶活化所必需的七边形结构[1] [7] [16]。 ATPase结构域中的突变使蛋白质失活;然而,控制这种ADP-ATP交换的方法尚不清楚。[1] [7] [16]因此,寡聚化只能在7个细胞色素c分子,7个Apaf-1蛋白和足够的(d)ATP / ATP存在下发生[7]。ATPase结构域属于AAA 家族的ATP酶;该家族以其与其他ATP酶结构域连接并形成六 - 或七聚体的能力而闻名[16]。当有七个Apaf-1分子排列成轮结构时,凋亡小体被认为是有活性的,其取向使得NB-ARC结构域位于中心。[1] [16] 这种功能性凋亡体可以提供半胱天冬酶9的平台激活。[1] [16]半胱天冬酶9作为胞质溶胶中的酶原存在,并且被认为在细胞中以20nM发现[16]。虽然已知酶原不需要为了变得活跃而被切割,[16]一旦切割,procaspase-9的活性可能显着增加[13]。第一个假设是凋亡体在切割前提供两个半胱天冬酶9分子二聚化的位置;这个假设在2007年受到了Reidl&Salvasen的青睐。第二个是当caspase 9仍然是单体形式时发生切割[13] [16]。在每种情况下,半胱天冬酶9激活导致完整半胱天冬酶级联的激活和随后的细胞死亡。有人认为,激活caspase级联的多聚蛋白复合物的进化原因是为了确保痕量的细胞色素c不会偶然引起细胞凋亡[7]。 尽管凋亡是自然身体功能所必需的,但凋亡体通路的突变引起灾难性效应和身体变化。细胞通路的突变可以促进细胞死亡或不允许细胞死亡,从而在体内产生大量疾病。由于缺乏凋亡体活性,由于过多的凋亡体活性引起的阿尔茨海默氏病以及许多其他神经退行性疾病如帕金森病和亨廷顿舞蹈病,导致疾病的突变凋亡途径很丰富并且具有广泛的范围。神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病,帕金森氏病和亨廷顿氏病都是年龄相关性疾病,并且涉及增加的细胞凋亡,其中细胞死亡仍然能够发挥功能或有助于支持组织功能。 Apaf-1-ALT是在前列腺癌中发现的Apaf-1突变体,其不具有残基339-1248。最近对凋亡小体的结构研究证明,Apaf-1-ALT不能形成凋亡小体,因为它缺少组装的关键结构成分[1]。 细胞内的遗传和生化异常通常会触发程序性细胞死亡,以消除身体不规则的细胞功能和发育;然而,癌细胞已经获得了允许它们抑制凋亡并存活的突变。像电离辐射这样的化学疗法已经开发出来,通过过度刺激来激活这些被抑制的PCD途径以促进正常的PCD [19]。 P53作为一种肿瘤抑制剂起作用,参与预防癌症,并在凋亡通路中自然发生。 P53导致细胞进入细胞凋亡并破坏进一步的细胞分裂,因此阻止细胞发生癌变(16)。在大多数癌症中,p53通路已经发生突变,导致缺乏终止功能失调细胞的能力。 P53功能也可能导致有限的生命周期,其中p53基因的突变导致产生长寿命动物的显性 - 负性形式的表达。例如,在使用线虫的实验中,发现p53突变体的寿命增加取决于增加的自噬。[19]在另一个使用果蝇(Drosophilia)的实验中,p53突变对成年期的寿命有正面和负面的影响,这导致了性别分化,PCD和衰老之间的联系[19]。确定p53如何影响寿命将是未来研究的一个重要领域。 细胞凋亡的抑制是癌症的关键特征之一,所以寻找操纵和克服这种抑制形成凋亡体并激活半胱天冬酶的方法在开发新的癌症治疗中是重要的。直接引起凋亡体激活的能力在癌症治疗中是有价值的,因为感染的癌性基因不能被破坏而导致癌症继续形成。通过外部刺激激活凋亡小体可以发生细胞凋亡并摆脱突变的细胞。目前正在寻求实现这一目标的许多方法,包括重组生物分子,反义策略,基因疗法和经典的有机组合化学,以针对特定凋亡调节因子来纠正人类疾病中过度或不足的细胞死亡。 通常,抗凋亡蛋白的上调导致防止细胞凋亡,其可以通过抑制剂来解决,并且抗凋亡蛋白的下调导致细胞凋亡的诱导,其被能够结合并修饰它们的活化剂逆转活动。基于细胞凋亡疗法的重要靶分子是用于药物设计的Bcl-2。 Bcl-2是第一个发现导致癌症抑制性细胞凋亡的致癌基因。它在肿瘤中过度表达并且对化学疗法有抗性[18]。科学家们发现,抑制Bcl-2抗凋亡蛋白的抑制剂抑制它们,并使直接活化剂自由地与Bax和Bak相互作用[18]。 另一种用于癌症治疗的靶向分子涉及半胱天冬酶家族及其调节子。半胱天冬酶活性的抑制阻断人类疾病中的细胞死亡,包括神经退行性疾病,中风,心脏病发作和肝脏损伤。因此,半胱氨酸蛋白酶抑制剂是提供中风和其他人类疾病治疗的有希望的药理学工具。有几种目前处于临床前阶段的半胱氨酸蛋白酶抑制剂已显示出有希望的证据,表明某些神经退行性疾病的逆转作用。在最近的一项研究中,研究人员开发了一种名为M-826的可逆性caspase-3抑制剂,并在小鼠模型中对其进行了测试,以此来阻断脑组织损伤。此外,它在亨廷顿舞蹈病的小鼠身上进行了测试,该抑制剂阻止横纹神经元死亡,揭示了对这种半胱氨酸蛋白酶抑制剂的进一步研究的有希望的作用[18]。 Apaf1 /半胱天冬酶-9凋亡体形成是凋亡级联中的关键事件。鉴定能够阻止或稳定活性凋亡复合物形成的新型潜在药物是治疗以凋亡过度或不足为特征的疾病的理想策略[18]。最近发现牛磺酸通过其抑制Apaf1 /半胱天冬酶-9凋亡体形成而不阻止线粒体功能障碍的能力来预防缺血诱导的心肌细胞凋亡。牛磺酸抑制凋亡体形成的可能机制被确定为能够降低凋亡体的基本组分caspase-9的表达。然而,有研究显示Aparf1和caspase-9具有除凋亡体以外的独立作用,因此改变它们的水平也可能改变细胞功能。因此,尽管有令人鼓舞的实验数据,但几个问题仍未解决,并限制了临床实践中使用实验药物。 凋亡抑制剂的发现将为治疗细胞凋亡介导的疾病提供新的治疗手段。特别重要的是那些能够通过作用于细胞内蛋白质 - 蛋白质相互作用而不改变凋亡体成分的转录水平来抑制凋亡体稳定性和活性的新化合物[18]。凋亡小体的最近结构研究可能为设计基于凋亡小体的治疗提供有价值的工具[1] [13]